PCRテスト

Maximilian Reindlは、ミュンヘンのLMUで化学と生化学を学び、2020年12月からhouseofgoldhealthproducts編集チームのメンバーになっています。彼はあなたのために医学的、科学的そして健康政策のトピックに精通し、それらを理解可能で理解できるようにします。

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PCR検査は、現代医学と分子診断の不可欠な部分になっています。それらは非常に正確であるため、「ゴールドスタンダード」と見なされます。それらは、病原体の検出から遺伝性疾患のスクリーニングまで、つまり、遺伝性物質のごくわずかな痕跡でも確実に検出する必要がある場合はどこでも、幅広いアプリケーションで使用できます。 PCRテストが非常に正確である理由、使用場所、および詳細な動作については、こちらをご覧ください。

PCR検査とは何ですか？

PCRテストは、分子生物学と医学からの実験室の方法です。このテストは、遺伝物質の直接検出（および特性評価）に使用されます。 PCR法は、専門家によって、実行が容易で、普遍的に適用可能で、堅牢であると考えられています。

実験室では、PCRテストは2つのステップで構成されています。最初のステップでは、既存の遺伝物質がポリメラーゼ連鎖反応、または略してPCRの助けを借りて複製されます。このようにして、DNAの最小の痕跡を調べることができます。これは、PCRテストが非常に敏感である理由でもあります。

2番目のステップでは、遺伝物質が分離され、「分類」され、その特性に従って特徴付けられます。したがって、DNAの微細構造が決定されます。

考えられる用途はたくさんあります。たとえば、医師はPCR検査を使用して、コロナウイルスの塗抹標本、HIVの献血、または新生児の遺伝性疾患のスクリーニングなどを行います。細菌感染症（結核病原体など）や寄生虫感染症（マラリア）もPCRで明らかにすることができます。

それらはまた、法医学が彼らの遺伝的指紋に基づいて犯罪者を有罪にするのを助けたり、父子鑑定として使用されたりします。

これらのアプリケーションはすべて、分子診断という用語で要約されています。したがって、PCRは、Sars-CoV-2病原体の検出をはるかに超えて、研究、診断、法医学における実用的なアプリケーションを見つけます。

（コロナ）PCRテストと高速PCRテスト

通常、PCR検査の評価は専門の研究所で行われます。これは、サンプル材料が送られ、そこで検査されることを意味します。結果は通常、数日後に受信されます。

最近、さまざまな新興企業（GNA Biosolutions、Spindiag）が新しいタイプのモバイルテストデバイスを発表しました。このため、彼らはまた、連邦医薬品医療機器研究所（BfArM）から特別な承認を受けました。これらのモバイルPCRテストデバイスの助けを借りて、PCRテストも専門の研究所なしで可能になります。

このアプローチは、サンプルが採取された場所（テストセンター）で数時間以内に直接信頼できるテスト結果を入手できるため、大きな可能性を秘めています。

そのような迅速なPCRテストシステムが実際に普及する程度はまだ評価できません。また、テストセンターにこれらのデバイスが全面的にどれだけ迅速に提供されるかもまだわかっていません。

したがって、当面の間、「定期的な」実験室ベースのPCRテストが引き続き実行され、サンプリングとテスト結果の間に一定の遅延が発生します。

PCRテストの信頼性はどれくらいですか？

PCRは、分子診断および医学における実証済みの検出方法です。これは、エラー率が非常に低い、いわゆるゴールドスタンダードと見なされています。テストは、非常に高い感度と特異性によって特に特徴づけられます。

感度とは、検査で検出される遺伝物質を見つける信頼性を意味します。

特異性とは、問題の遺伝物質がサンプルに存在しないことをテストが決定する確実性を意味します。

Sars CoV-2感染の場合、PCR検査はいつ機能しますか？

原則として、PCR検査は症状の発症の2〜3日前から最大20日後にコロナ感染を検出します。完全に無症状のままである感染した人々でさえ、彼らが他の人に感染することができる重要な時間枠でテストは機能します。

個々のケースでは、これの証拠は病気の症状が現れてから60日後にさえ可能です。

コロナ感染後の初日には、感染が存在していてもPCR検査が陰性になることもあります。このような場合、スミアテストの時点で喉に十分なウイルスがありませんでした。ただし、感染の疑いがある場合、医師は通常、翌日に別のPCR検査を実施します。

エラーの考えられる原因

DNAコピープロセスのエラー率は実際にはごくわずかです。 DNAポリメラーゼは決して適切に機能しませんが、PCRテストプロセスではほとんど役割を果たしません。

実際には、考えられるエラーの原因はサンプリングプロセスにあります。したがって、訓練を受けた医療スタッフが塗抹標本を実行することが重要です。ここで希釈効果が発生するため、唾液とうがい薬のサンプルは精度を低下させる可能性があります。

PCRテストはどのように機能しますか？

PCR検査は、例えばかかりつけの医師や特別な検査センターで実施されます。まず、医師または訓練を受けた医療専門家がサンプルを採取します。通常、スワブはテストのために上気道から採取されます。これは通常、口または鼻と喉の綿棒の形をとります。

すすぎ液でうがいをすることも可能です。血液サンプルはコロナ検出には非定型ですが、たとえば新生児スクリーニングでは広く見られます。

採取したサンプルの種類に関係なく、遺伝物質は綿棒、すすぎ液、または一滴の血液に含まれています。このサンプル材料は研究所に送られ、そこで分離および精製されます。

次に、PCRテストは2つのステップに分けられます。

PCR：このステップでは、元の遺伝物質の量が乗算されます。
電気泳動：2番目のステップでは、ゲノムセグメントがサイズに従って「ソート」されます。このようにして、サンプルの特性を明らかにすることができます-遺伝物質の微細構造が決定されます。

ステップ1：PCR-「ポリメラーゼ連鎖反応」

「PCR」は、2つの作業ステップの最初のステップです。ここでは、既存の開始DNAの量が乗算されます。なぜなら、遺伝物質が十分な量で入手できる場合にのみ、それを調べることができるからです。ほとんどの場合、これはヒトDNAです。したがって、コロナウイルスの検査はウイルスRNAです。

略語PCRは、英語の用語「ポリメラーゼ連鎖反応」の略です。

PCRには何が必要ですか？

出発DNAは、特殊な物質が入った反応容器にあります。既存の遺伝物質はテンプレートとして機能し、特定の酵素（Taqポリメラーゼ）および特定の基本的なDNAビルディングブロックの存在下でコピーされます。

コピープロセスは、複数の繰り返し実行（サイクル）で行われます。

具体的には、以下の物質が組み合わされています。

開始DNA：複製されるサンプル材料。
基本的なDNAビルディングブロック：これらは、核酸塩基であるアデニン、チミン、シトシン、およびグアニンです。
DNAポリメラーゼ：個々のDNAビルディングブロックをリンクして、明確に定義されたDNA鎖を形成する酵素。新しく取得されたストランドは、元の出発材料のミラーリングされた（補完的な）画像です。
緩衝液：ポリメラーゼ連鎖反応は、生理学的緩衝液中で起こります。これにより、ヒトの細胞に見られるのと同様の状態が保証されます。この溶液はpHを安定に保ち、マグネシウムイオンも含んでいます。これらの制御された条件は、DNAポリメラーゼの機能を確保するために必要です。
プライマー：16〜24塩基対で構成され、開始位置と開始信号として機能します。プライマーは、（開始DNAの）コピープロセスが開始するDNAポリメラーゼを示します。

PCRテストはどのように行われますか？

PCRに必要なすべての物質が反応容器に入っているので、遺伝物質の実際のコピープロセスを開始できます。これは、温度によってのみ開始、制御、および停止されます。

その結果、反応容器は、目標とする方法で異なる温度に加熱または冷却される。これは、特別な装置、いわゆるサーマルサイクラーを使用して行われます。全体的な反応には約1〜2時間かかります。

PCRサイクルの個々のステップは次のとおりです。

DNA二本鎖の変性：サンプルは摂氏約90度に加熱されます。その結果、元のDNA二本鎖は2つの別々の（相補的な）一本鎖に切断されます。
プライマーの取り付け：温度を摂氏60度よりわずかに低くします。その結果、プライマー（フォワードプライマー、リバースプライマー）は、対応するDNAの一本鎖上の定義された位置に付着します。
延長：温度は摂氏70度をわずかに超えるまで上昇します。 DNAポリメラーゼは、この最適な温度で作業を開始します。プライマーの位置に付着し、正確な（相補的な）コピーが利用可能になるまで（DNA合成）、DNAの元の一本鎖を段階的に延長します。

サイクルが完了すると、温度は再び摂氏約90度まで上昇し、サイクルが最初からやり直しになります。

PCR法を使用すると、DNA配列を最大約3キロベースペア（kbp）まで複製できます。これは、「チェーン」を形成するためにリンクされた約3,000の基本的なDNAビルディングブロックに対応します。比較のために、ヒトゲノムは細胞の操作に関する青写真と情報を約30億塩基対で保存しますが、コロナウイルスゲノムは30,000塩基対で構成されています。 PCRテストは、全DNAの短いセクションを複製および検査するためにのみ使用できます。

プライマーは非常に重要です

プライマーの選択は、PCRプロセスにとって重要です。たとえば、Sars-CoV-2診断では、いくつかのプライマーが使用されます（マルチプレックスPCR）。

コロナPCRテストは3つの異なるウイルス遺伝子を探します：全体的な特異性はほぼ99.99％に増加します。これは、この高いヒット率では、10,000回の検査ごとに1つの偽陽性テストしか存在しないことを意味します（サンプルが正しく取得された場合）。

コピーされた遺伝物質は今どれくらいありますか？

最初のサイクルの後、2本の同一のDNA二本鎖があると仮定しましょう。

各サイクルの後、（コピーされた）遺伝物質の量は2倍になります。したがって、DNAの量は指数関数的に増加します。

言い換えれば、2番目のサイクルの後に4つの同一のダブルストランドがあります-3番目のサイクルの後に8つのダブルストランド-4番目のサイクルの後に16のダブルストランドと5番目のサイクルの後にすでに32のダブルストランドがあります。

医療専門家は通常、このプロセスを約20〜30回繰り返します。

比喩的に言えば、これは次のことを意味します。最初にサンプルでDNA二本鎖が1つしか見つからなかったとしても、20サイクル後、反応容器にはすでに100万個の同一のコピーがあります。

Ct値はどういう意味ですか？

完了したPCRサイクルの数は、いわゆるCt値の形式で示されます。「Ct」は、英語の用語「サイクルしきい値」から派生しています。このCt値により、求められている遺伝物質の量についてステートメントを作成できます。

20の低いCt値では、多くの開始遺伝物質があります。ただし、Ct値が高い場合（約30サイクル）、それに応じてDNAはほとんどありません。したがって、PCRサイクルはより頻繁に実行する必要があります。

ステップ2：電気泳動「サイズによる分類」

最後に、十分な「濃縮された」遺伝物質があれば、電気泳動として知られていることが起こります。科学者はDNAの特定の特性を使用します：その電荷。

個々のDNAビルディングブロックは、（負に）帯電した糖リン酸バックボーンを介して相互にリンクされています。特定のDNA配列が長いほど、その電荷は高くなります。

遺伝物質が特定の担体媒体（アガロース）に入れられ、電圧が印加されると、DNAセグメントはそれらの電荷のために動き始めます。 DNAの長いストレッチは短いフラグメントよりも速く移動するため、サイズに応じて分離します。

このようにして、遺伝物質を調べて特徴づけることができます。実際には、既知の参照を持つ未知のサンプルは通常、「開始ライン」に適用され、一定期間後に相互に比較されます。

「移行速度」が両方のシーケンスで同じである場合、これは次のことを意味します。検出が陽性である可能性が非常に高い-探している遺伝子がサンプルに含まれている。

コロナウイルスの特殊なケース：サンプル準備とRT-PCR

コロナウイルスの病原体検出は特殊なケースであり、Sars-CoV-2はいわゆるRNAウイルスの1つです。これは、Sars-CoV-2ゲノムがRNA（リボ核酸）の形であることを意味します。

RNAはいくつかの点でのみDNAと異なります。とりわけ、それは一本鎖として利用可能であり、2 "デオキシリボースの代わりに糖リボースに基づいています。核酸塩基チミンも4番目の塩基としてウラシルに置き換えられました。

このウイルスRNAは、通常のPCRテストの前にDNAに「転写」される必要があります。このプロセスは逆転写（RT）と呼ばれるため、RT-PCRという用語が使用されます。このプロセスの過程で、単一のcDNA鎖（「相補的DNA」）が得られます。さらなるステップでは、単一のcDNA鎖に2番目の鏡面反転DNA鎖が追加されます。

サンプル準備の最後に、ウイルスRNAの元の青写真に対応するDNA二本鎖があります。この二本鎖のみがPCRテストのテンプレートとして使用できるようになりました。